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线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书
点击次数:65 发布时间:2019-04-18

货号: YJ2273                                                    规格:25管/24样

线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书

可见分光光度法

产品内容:

试剂一:25mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:0。5 mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂四:液体10mL×2 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×2 支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×2 支,-20℃保存;

产品说明

    线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C 氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素C 的氧化,并最终把电子传递给氧,生成水。还原型细胞色素C 550nm 有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色素C,因此550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

正式实验前务必取2-3个预期差异较大的样本做与测定。

一、样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

  1. 准确称取0.1g 组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
  2. 将匀浆600g4℃离心5min
  3. 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min
  4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。
  5. 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。

二、测定步骤:

  1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。
  2. 样本测定
  1. 工作液的配制:临用前取试剂四、试剂五、试剂六各一支,将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解。分批配制工作液是为了防止当天不能测完,导致工作液失效。
  2. 将工作液置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂4℃可保存一周;
  3. 1mL 玻璃比色皿中加入40μL 样本和800μL 工作液,立即混匀,记录550nm 处初始吸光值A1  1min 后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。

注意:若ΔA 大于0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),使A1-A2 小于0。2,可提高检测灵敏度。

三、复合体Ⅳ活力单位的计算:

  1. 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

  1. 按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 样总)÷T=222×ΔA÷W

  1. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 样总)÷T=0.444×ΔA

    V 反总:反应体系总体积,8.4×10-4 Lε:细胞色素C 摩尔消光系数,1.91×104 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.04 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,1 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数,500 万。

 

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