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Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定说明书
点击次数:130 发布时间:2019-04-18

货号:YJ2275                                                  规格:50管/24样

Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定说明书

可见分光光度法

产品说明

Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。根据Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP 酶活性高低。

需自备的仪器及用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体50mL ×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 5ml×1 瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×3 支,-20℃保存。用时每支加1mL 蒸馏水,现用现配。用不完的试剂-20℃可保存一周。

试剂五:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。

试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入3mL 蒸馏水, 4℃保存。

试剂七:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水,溶解后4℃保存一周。

试剂八:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水,溶解后4℃保存一周。

试剂九:液体25mL×1 瓶,室温保存。

试剂十:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂十20倍稀释,即取 0.1mL试剂十加1.9mL蒸馏水

充分混匀

定磷剂的配制:按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备:

  1. 细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织,加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

  1. 血清(浆)样品:直接检测。

操作步骤:

  1. 分光光度计预热30min 以上,调节波长至660nm,蒸馏水调零。
  2. 酶促反应(在EP 管中加入下列试剂)

 

对照管

测定管

试剂一(μL)

130

90

试剂二(μL)

40

40

试剂三(μL)

40

40

试剂四(μL)

40

40

试剂五(μL)

 

40

样本 (μL)

 

200

混匀,37℃(哺乳动物)或25℃(其他物种)准确水浴10min

试剂六(μL)

50

50

样本 (μL)

200

 

混匀,8000g,常温离心10min,取上清液

  1. 定磷(1。5mLEP 管中依次加入下列试剂)

 

空白管

标准管

对照管

测定管

0。5μmol/ml 标准磷应用液(μL)

 

100

 

 

上清液(μL)

 

 

100

100

蒸馏水(μL)

100

 

 

 

定磷试剂(μL)

1000

1000

1000

1000

混匀,室温放置30 min,在 660nm 处比色。

注意事项:

  1. 由于每一个样都必须做对照,本试剂盒50管只能测24份Ca++ Mg++-ATP 酶。
  2. 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。
  3. 空白管和标准管只要做一管。

计算

  1. 血清(浆)Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:

定义:规定每小时每毫升血清(浆)中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/mL)=[ C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A空白管)÷V 样÷T=7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

  1. 组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算:
  1. 按蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++- ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

ATP 酶活力(U/ mg)=[C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V 样×Cpr)÷T =7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

  1. 按样本鲜重计算:

定义:每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/g)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(W× V 样÷V样总)÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

  1. 按细菌或细胞密度计算:

定义:规定每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP 酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(U/104)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(500×V 样÷V样总)÷T=0。015×(A测定管-A 对照管)÷(A标准管-A空白管)

 

C 标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积,0.5mL;V 样:加入样本体积,0.2mL ;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6 小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

 

 

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