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线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书
点击次数:173 发布时间:2019-04-18

货号YJ1219                                                规格:100管/48样

线粒体复合体Ⅴ试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成,也可逆过程水解ATP。此外,复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理:

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi,通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:80mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:2mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五:8mL×1 瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入4mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂七:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂八:粉剂×1瓶, 4℃保存;临用前加入10mL蒸馏水,充分混匀;溶解后4℃保存一周;

试剂九:液体 10mL×1 瓶,室温保存。

定磷试剂的配制:按H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染(请根据需要,用多少配多少)。

注意:配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ(此步可选

做)。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入800uL试剂二和8uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅴ酶活性测定。

测定步骤:

  1. 酶促反应(在EP管中加入下列试剂)

试剂名称(μL)

对照管

测定管

试剂四

20

20

试剂五

80

80

样本

 

100

混匀, 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)准确水浴 30min

试剂六

40

40

样本

100

 

混匀,4000g,25℃离心 10min,取上清液

  1. 定磷(在EP管或96孔板中加入下列试剂)

上清液

30

30

定磷试剂

170

170

混匀,室温静置10min后,在660nm处读取A测定管和A对照管,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

复合体Ⅴ活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y= 1.2487x + 0.0361;x为标准品浓度(mmol/L),y为A 值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×106]÷(V样×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /g 鲜重)=[(ΔA-0。0361) ÷1。2487×V 反总×106]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L; V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

b。使用96孔板测定的计算公式如下:

标准条件下测定的回归方程为y=0.624x + 0.0361;x为标准品浓度(mmol/L),y 为A 值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0。0361) ÷0。624×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反总×106]÷(W×V 样÷V 样总) ÷T=103。4× (ΔA-0。0361) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0。206× (ΔA-0。0361)

V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4 L;V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,0.808 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

 

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