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聚合酶链式反应ELISA法
点击次数:149 发布时间:2019-06-30

聚合酶链式反应ELISA法

聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学技术中检测DNA最灵敏的方法之一,而酶联免疫吸附测定法(ELISA)是免疫学中最敏感和特异的检测方法的代表。聚合酶链式反应ELISA法(PCR-ELISA)集上述两方法之精髓,成为继PCR之后又一个灵敏性更高、特异性更强、省时易行的新方法[7]。根据生物素和地谷新标记底物的不同,PCR-ELISA主要分为两大类:第一类为用生物素和地谷新同时对PCR产物进行标记;第二类则是分别对PCR扩增产物和核酸杂交探针进行标记。

生物素和地谷新同时标记PCR产物主要有三种途径:①在PCR反应混合物中同时加入生物素和地谷新标记的脱氧核苷酸类似物(DIG-Bio-dUTP);②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地谷新标记的引物2。实验方法如下:将标记的PCR产物用乙醇沉淀,或用纯化柱除去未结合的标记物,加至亲合素包被的酶标板孔中孵育1~2h,彻底洗涤,加抗地谷新抗体,然后加入碱性磷酸酶结合物底物孵育,终止反应后,根据吸光度(A)值判断结果。这类亲合素介导的固相捕获生物素标记的靶分子检测系统,灵敏度高于PCR检测,且操作简便、快速,重复应用性好,可以在短时间内(<4h)准确检测大量的临床标本(血清、分泌液或甲醛固定标本);通过适当调整PCR循环次数及相关参数并对多时间点上产量进行线性分析,可对PCR产物进行定量分析。由于检测系统是建立在双标记核酸片段上的,有时会出现非特异性PCR产物吸附,引起本底偏高的现象。

第二类PCR-ELISA为生物素和地谷新分别标记PCR扩增产物和核苷酸探针。用生物素化的引物进行PCR扩增,然后加入亲和素包被的酶标板中,冰浴1h,经洗涤后加入变性剂(50mmol/L NaOH)室温作用数分钟,加入杂交液和地谷新标记的探针,杂交完成经洗涤后加入碱性磷酸酶标记的抗地谷新抗体,室温下作用1h经充分洗涤后加显色剂,读取A值。该方法利用生物素化引物获得含生物素的PCR产物,使产物能与包被在酶标板上的亲和素牢固地结合,使特异性PCR扩增产物吸附于酶标板上,继而用地谷新标记的探针进行杂交和放大,这一方法特异性强,灵敏度高,重复性好。

PCR-ELISA方法的优越性主要表现在以下四个方面。①利用生物素-亲和素系统的强大亲和能力,其亲和常数K约为抗原抗体的104~107倍,为A蛋白(SPA)对IgF。的108倍。生物素和亲和素二者高度特异的快速结合,不易受外界干扰,复合物十分稳定,极少发生离解,提高了实验的稳定性,缩短了反应时间。此外,亲和素不含糖基,等电点为pH=6.0,与其他抗原或抗体包被酶标板比较,其非特异性吸附显著减少,灵敏度得到提高。②PCR扩增使阳性信号通过扩增本身以及地谷新抗原抗体反应得到极大程度的放大,从而使检测的灵敏度进一步提高。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸转移酶的使用,使PCR技术中交叉污染得以极大程度的控制而不影响检测效果,基本克服了PCR杂交技术中由于污染造成的假阳性问题。④标记探针的使用,使检测的特异性进一步提高,可以与放射性标记的Southern杂交相媲美,且探针的引进使其应用的范围增大,比PCR本身在基因多态性分析、病毒分型、克隆鉴定等方面显示了其独特的优势。另外,非同位素标记系统的应用又避免了使用同位素带来的危害,而且整个实验周期较Southern杂交明显缩短(约 6h),并且操作简便,可用于大批量标本的同时检测。当然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求,其中PCR产物和探针的杂交条件(PCR产物的稀释度、杂交温度和时间)与检测敏感性、特异性有密切关系。

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