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酶联免疫吸附试验
点击次数:138 发布时间:2019-06-30

酶联免疫吸附试验

       ①直接法    该方法直接利用抗原 与酶联抗体的结合,较简单易行。A.假抗原。在聚苯乙烯酶标版的孔穴中加入待检测的抗原(捕食者胃内含物抽提液)0.2mL,在4℃冰箱中过夜,使抗原黏附于塑料孔壁上。B.洗涤两次,倒置于干毛巾上,使孔穴中的液体尽量流出。c.加酶联抗体。 各孔穴中加入酶联抗体0.2mL,在mL37℃下孵育3h,使其充分结合。d. 加底物。 用PBS充分洗涤以除去未结合的酶联抗体,然后加入底物(邻苯二胺)0.2 mL,于37℃反应30min,用2mol/L硫酸0.05 mL终止反应。e. 用ELISA检测仪测定其吸光度值,分别设阳性、阴性和空白对照,以确定阳性反应临界值。

        ②双抗体夹心法   该方法与直接法的不同在于吸附抗体。a. 包被抗体。酶标板的孔穴中加入0。2 mL抗体(用PH=9。6/0。05mol/L碳酸盐缓冲液稀释),置37℃水浴中孵育3h,移入4℃冰箱过夜。将各孔中多余的抗体倾去,加入PBS洗涤,立即甩去,再将PBS加满各板孔,置5min,甩去溶液,如此洗涤2次,倒置于干毛巾上,使孔穴中的液体尽量流出。b。 加待检抗原。没孔中加入待检捕食者胃内含物抽提液0。2 mL。同时设阳性、阴性和空白(PBS对照,37℃水溶中孵育3h,转入冰箱中过夜。如上法洗涤3次。C. 加入酶联抗体。每孔加入酶联抗体0.2 mL,37℃水浴孵育2h,如上法洗涤3次。d。 加底物。 每孔加入底物邻苯二胺0.2 mL, 37℃水浴孵育1h,加入2mol/L硫酸0.05,以终止反应。e. 用 ELISA检测仪测定其吸光度值。

       ③间接法  与前两种方法不同点在于酶联抗体与抗原的间接结合。a. 每孔加入待检抗原0.2 mL ,4℃冰箱中过夜,使抗原黏附于塑料孔壁上。并依上法洗涤3次。b. 每孔加0.2 mL,用PBS稀释的抗体,37℃孵育2-3h。c.用PBS洗涤3次后,加入溶于PBS的酶联抗体0.2mL,37℃孵育2-3h。d. 加底物,方法同上。e. 用ELISA检测

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