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ELISA原理(实验条件、技术要点)

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ELISA原理(实验条件、技术要点)


实验条件和技术要点:

酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,简称ELISA)与免疫酶测定等名称所指的内容是不相同的,ELISA的内容专指固相吸附技术和免疫酶标抗体(或抗原)技术相结合的一种方法,它是将抗原或抗体包被在固相支持物(或称载体上),然后再进行免疫反应,形成酶标记的抗原抗体复合物,反应完毕,借助底物显示特异结合的标记抗体(或抗原)上的酶活性,用酶与底物反应后生成的有色产物进行光密度测定,达到抗原或抗体定量的目的。

在应用ELISA时,首先要清楚下面内容:1,是检测抗体还是抗原?2,检测的结果是定性还是定量?3,是否需要检测特异抗体的类型?4,所用抗体/单克隆抗体的亲和力怎样?

(1)检测抗原  zui常用于检测抗原的方法是非竞争性的双抗体夹心法,其次是竞争法。但竞争法在具体实验中有些困难,特别是检测微生物的抗原,因为需要标记抗原,这对于某些抗原是很难做到的,甚至是不可能的。另外在竞争法中,酶标记的抗原与标本直接混合在一起,许多标本中含有酶抑制剂或蛋白A样物质,可影响ELISA的结果。

(2)检测抗体  检测抗体种类常用的方法是检测抗体种类的捕获法,这个方法常用于检测特异性IgGIgAIgM.。这个方法的*步是捕获所需要检测的一个种类的抗体,接下来是检测捕获的抗体是否是特异性抗原的抗体。间接ELISA在检测IgG时比较简单,但不适用于检测其他种类的抗体,因为血清中如果有特异IgG存在将与IgM或IgA等竞争结合抗原。

竞争法检测抗体有两种方法:一种是将标记的抗体和标本同时加入反应孔内,但标记的抗体和标本中的抗体必须是结合抗原的不同决定簇;另一种是先加标本,冲洗后再加标记的抗体。竞争法检测抗体比间接法容易判断结果,并且比较敏感和特异。不论选择哪种方法,ELISA都包括6个步骤:1,抗原或抗体吸附于固相;2.加标本和试剂;3,孵育和冲洗;4,加酶标抗原或抗体;5,加适当的底物;6,检测和分析结果。

虽然ELISA法在理论上十分简单,但每一步都有要注意的事项。不论是新设计的ELISA还是沿用其他ELISA方法都有以下几方面技术要点:固相载体的选择和试剂的制备,反应条件和操作的标准化。酶标记抗原竞争法利用混合的未标记抗原和酶标记抗原相互竞争抗体上的结合点,从而进行抗原的定量。未标记抗原的量越大,则酶标记抗原和抗体的结合就越受到抑制。但是竞争法在实验时比较复杂,有时在抗原混合液与相应抗体孵育后,在测定游离抗原与抗体相结合抗原的活性以前,要先进行盐析或有机溶剂沉淀或第二抗体沉淀等方法把两种不同存在形态的抗原分开。并且在加入底物后,容易产生血清色的物质。因此,每次测定时都需做空白对照。由于这些缺点,酶标记抗原竞争法使用不多。

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